PCR擴(kuò)增STR等位基因的產(chǎn)物中包含著許多DNA分子,怎樣分離這些產(chǎn)物是具有挑戰(zhàn)性的問題。一個復(fù)合擴(kuò)增PCR反應(yīng)可以產(chǎn)生20個或更多的DNA片段,而這些片段必須要能彼此準(zhǔn)確地區(qū)分,包括那些僅有一個堿基差異的等位基因(例如THO1基因座上的等位基因9.3和10)。通常分離單堿基差異的DNA片段長度均在100至400bp之間。這些分離方法必須能使結(jié)果重現(xiàn),并可在不同實(shí)驗(yàn)室間進(jìn)行比對,這是非常重要的。
為了區(qū)分不同的分子,需要一種能分離不同長度片段的技術(shù)。常用的分離方法即電泳,包括平板電泳和毛細(xì)管電泳。
對于短串連重復(fù)DNA的PCR產(chǎn)物,其分離方法必須能區(qū)分每一個等位基因。雜合性等位基因可以通過電泳分離不同長度的片段,倒如,平板電泳或毛細(xì)管電泳。
電泳( electrophoresis) -詞來源于希臘語electron和拉丁語phore,因?yàn)殡娪镜倪^程依賴于分子所攜帶的電荷。對于DNA而言,其磷酸根基團(tuán)帶有負(fù)電荷,而核酸之所以呈酸性也是因這些磷酸根基團(tuán)很容易釋放出氫離子,使核酸在絕大多數(shù)緩沖液中帶有負(fù)電荷。在電場作用下,DNA分子將離開陰極向陽極泳動。電壓越高,DNA分子所受的電場力就越大,移動速度也就越快。
離子在電場中的移動會產(chǎn)生熱量,這些熱量必須要散發(fā)掉,否則會被系統(tǒng)吸收。過量的熱會使凝膠產(chǎn)生弧形的電泳譜帶,在一些特殊的情況中?凝膠也會融化和斷裂。正如本章結(jié)尾部分所討論,毛細(xì)管電泳之所以具有很強(qiáng)的優(yōu)越性,因?yàn)槊?xì)管具有較高的表面積與體積之比使散熱更為容易。
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