高分辨率熔解技術(high resolution melting，HRM)僅僅通過PCR之后的熔解曲線分析，就能檢測PCR片段的微小序列差異，從而應甩于突變掃描、序 列配對和基因分型等多個方面(Liu et al一2010)。雙鏈D\A的熔解分析可追溯到20世紀60年代，當時是通過紫外吸收來監(jiān)測的。分析需要幾微克的DNA，而樣品以(0.1～1.0)℃／min的速率緩慢加熱，常常要花上幾個小時才能完成：后來，LightCycler定量PCR儀的出現(xiàn)，讓熒光熔解分析變得流行：樣品量因毛細管而縮減至納克級，且熔解速率更快，達(0.1～1.0)℃/S，熔解時間縮短至幾分鐘，當時使用的染料是SYBR Green I。然而，這種熔解分析只能區(qū)分在片段大小和GC含量上差別較顯著的DNA序列，如檢查PCR擴增產物中是否存在引物二聚體及其他非特異性的擴增。如果要區(qū)分SNP，分辨率還不夠。SYBR Green I屬于非飽和性染料，由于它對PCR的抑制作用，在實驗中的使用濃度很低，遠未將DNA雙螺旋結構中的小溝飽和。這樣，DNA雙鏈高溫變性時，單鏈部分的熒光染料分子發(fā)生重排，熒光染料分子重新結合到雙鏈DNA的空置位點，造成熒光信號沒有變化，因此出現(xiàn)假陰性，特異性下降。而飽和染料即便在飽和濃度（熒光最大）下，也不會抑制PCR，故高濃度的染料飽和了DNA雙螺旋結構中的小溝，在DNA觶鏈過程中就不會發(fā)生重排，這樣熔解曲線才有了更高的分辨率。目前市場上的飽和染料主要有LC Green、LC G，een Plus等幾種。
擴增子的熔解曲線完全取決于DNA堿基序列。序列中如有一個堿基發(fā)生了突變，就會改變DNA鏈的解鏈溫度，但是這個差異極小，只有零點幾攝氏度，如果儀器的分辨率不高，是根本無法檢測的。那么什么樣的分辨率才是高分辨率呢？根據(jù)儀器現(xiàn)有的功能測試，在熔解操作時每攝氏度至少要獲得10個數(shù)據(jù)點，這是對儀器的最低要求。此外，溫度均一性也同樣重要。如果兩孔之間溫度相差0.1℃，就很可能導致最終的熔解溫度相差0.1℃，這樣就無法保證HRM分析結果的準確性。大多數(shù)常規(guī)定量PCR儀的孔間溫度差為0.3～0.5℃，這也決定了它們無法勝任HRM。
目前市場上有多個廠家提供HRM分析的儀器，包括Idaho Technology、Corbett (QIAGEN)、Roche等，有些是專供HRM的儀器，有些則是附帶HRM功能的定量PCR儀。在擁有飽和染料和高分辨率儀器之后，HRM分析過程其實很簡單，就是對PCR的擴增子進行加熱，溫度從50℃逐漸上升到95℃。在此過程中，擴增子逐漸解鏈，在到達熔解溫庋(L)時，DNA鏈完全分開。在HRM分析的初期，熒光強度很高，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強度也就隨之下降了。HRM儀器通過照相機記錄下熒光變化的整個過程。通過對數(shù)據(jù)進行作圖，就生成了熔解曲線。
綜上所述，HRM技術應用廣泛，操作簡單又經(jīng)濟，結果精確且可靠，適合任何實驗室使用。市場上有一些專供HRM分析的儀器，不過，那些帶有HRM功能的定量PCR儀則更實用。QIAGEN的Rotor-Gene Q(Corbett Rotor-Gene 6000)就是全球第一臺將實時擴增與HRM分析技術相結合的實時熒光定量分析裝置。Rotor-Gene Q的溫度均一性為0.01℃，解決了溫度均一性，精確性和分辨率的問題，實現(xiàn)了定量擴增與HRM的合二為一。
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